Биофизика пособие. Биофизика пособие

БИОФИЗИКА. В.Ф. Антонов A.M. Черныш В.И. Пасечник С.А. Вознесенский Е.К. Козлова. Москва. под редакцией профессора В.Ф. Антонова.

    Полина Новикова 2 лет назад Просмотров:

    1 УЧЕБНИК ДЛЯ ВУЗОВ В.Ф. Антонов A.M. Черныш В.И. Пасечник С.А. Вознесенский Е.К. Козлова БИОФИЗИКА под редакцией профессора В.Ф. Антонова Издание первое Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений Москва ВЛАПОС 2000

    2 ББК Б63 Авторы: В.Ф. Антонов, A.M. Черныш, В.И. Пасечник, С.А. Вознесенский, Е.К. Козлова Рецензенты: кафедра биофизики биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. кафедрой, член-корреспондент РАН, профессор А.Б. Рубин; директор Института нормальной физиологии имени П.К. Анохина, академик РАМН, профессор К.В. Судаков; зав. кафедрой биофизики медико-биологического факультета РГМУ, академик РАМН, профессор ЮЛ. Владимиров Биофизика: Учеб. для студ. высш. учеб. заведений. Б63 М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, с. ISBN В учебнике излагается биофизическая сущность организации и функционирования биологических объектов на клеточном, тканевом уровнях, на уровне органов и организма в целом. Раскрывается природа ионного обмена, биоэлектрогенеза, биомеханики мышечного сокращения и системы кровообращения. Большое внимание уделено методам моделирования биологических процессов. Рассмотрены проблемы взаимодействия биосферы и физических полей окружающего мира. Обсуждаются проблемы собственных излучений организма человека. Прилагаются типовые тесты по каждой главе учебника. Данному учебнику предшествовали два издания учебного пособия этих же авторов. ББК Антонов В.Ф., Черныш A.M., Пасечник В.И., Вознесенский С.А., Козлова Е.К., 1999 «Гуманитарный издательский центр ВЛАДОС», 1999 Серийное оформление. ISBN Художник Токарев Ю.В., 1999

    3 ПРЕДИСЛОВИЕ Биофизика как учебная дисциплина для подготовки специалистов-биофизиков различного профиля преподается уже более 40 лет. В настоящее время эта дисциплина наряду с другими (молекулярная биология, биохимия, физиология и др.) стала базой фундаментального курса наук о жизни. В этом качестве биофизика становится необходимой для специалистов-небиофизиков, среди которых медики, фармацевты, специалисты сельского хозяйства, ветеринарии и др. Биофизика в последнее время представляет интерес и для некоторых гуманитарных специальностей. В связи с этим очевидна необходимость подготовки комплекта учебных пособий по биофизике, ориентированного на специалистов в области наук о жизни, которые в дальнейшем не будут профессиональными биофизиками. В соответствии с действующими учебными планами и программами место биофизики определено на младших курсах и она имеет, как правило, ограниченный объем часов. С учетом этого обстоятельства необходимо точное определение минимальной базы для чтения курса и тесной интеграции курса с последующими учебными дисциплинами. Опыт преподавания курса биофизики в медицинском вузе показывает, что минимальной базой дисциплины могут быть вузовские курсы физики, биологии, органической химии. При необходимости предлагаемый курс биофизики может быть реализован на базе углубленных школьных курсов по естественным предметам. В соответствии с рекомендациями Международного союза прикладной и чистой биофизики, биофизика включает в себя молекулярную биофизику, биофизику клетки и биофизику сложных систем. Такая градация однако обязательна для научных исследований в области биофизики, в то же время программа учебной дисциплины может отличаться от указанных рекомендаций. В предлагаемом учебном комплекте «Биофизика» предусмотрена ориентация на учебные дисциплины физиологического профиля, поэтому основное внимание уделено клеточной биофизике и биофизике сложных систем. Вопросы молекулярной биофизики традиционно рассматриваются в курсе «Биофизическая химия». Данному учебнику предшествовали 2 издания учебного пособия «Биофизика» этих же авторов. Авторы считают своим 3

    4 приятным долгом выразить благодарность сотрудникам кафедры медицинской и биологической физики Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, принимавшим участие в плодотворном обсуждении материалов книги. Отдельные главы настоящей книги написаны следующими авторами: Глава 1 — В.Ф. Антонов, С.А. Вознесенский Глава 2 — В.Ф. Антонов, С.А. Вознесенский Глава 3 — В.Ф. Антонов, С.А. Вознесенский Глава 4 — A.M. Черныш,В.И. Пасечник Глава 5 — С.А. Вознесенский, A.M. Черныш Глава 6 — A.M. Черныш, В.Ф. Антонов Глава 7 — A.M. Черныш Глава 8 — Е.К. Козлова Глава 9 — Е.К. Козлова, A.M. Черныш Глава 10 — С.А. Вознесенский, A.M. Черныш Глава 11 — A.M. Черныш Глава 12 — В.И. Пасечник

    5 ВВЕДЕНИЕ Предсказуемое будущее развития естественных наук свидетельствует об ожидаемом расцвете в следующем столетии наук о жизни. Важное место среди них занимает биологическая физика. Являясь преимущественно биологической наукой, поскольку основной объект исследования представляет собой живой организм, биофизика в полной мере использует универсальный характер основных физических законов и строгость математических подходов при изучении процессов жизнедеятельности. С учетом этого биофизика может быть определена как наука о наиболее простых и фундаментальных взаимодействиях, лежащих в основе биологических явлений. Специфика живого впервые проявляется на молекулярном уровне строения органического мира. В свое время основатель квантовой механики Э. Шредингер в своей знаменитой книге «Что такое жизнь с точки зрения физики» впервые сформулировал и дал ответ на ряд вопросов биофизики. Было подчеркнуто, что с точки зрения физики живой организм относится к открытым термодинамическим системам с непрерывным обменом веществом и энергией с окружающей средой. Поразительную устойчивость живого организма в условиях принципиальной неравновесности протекающих в нем процессов Шредингер объяснил непрерывным оттоком энтропии из организма в окружающую среду. Второй вопрос, важный с точки зрения физики, — почему любой живой организм состоит из огромного количества атомов? Ответом является указание на то, что система, состоящая из небольшого количества атомов, не может быть упорядоченной. Любая флуктуация в результате теплового движения частиц должна была бы разрушать систему, что не совместимо с жизнью. Современный этап развития биофизики начался, по существу, с выдающихся открытий Л. Полингом пространственной структуры белка и Д. Уотсоном и Ф. Криком знаменитой спирали жизни — двойной спирали ДНК. Последовательное применение физических методов и представлений при изучении надмолекулярных мембранных структур привело к открытию ионной природы биоэлектрических явлений (А. Ходжкин, А. Хаксли, 5

    6 Б. Катц, Дж. Икклс, Р. Кейнс). Как оказалось, ключевую роль играют мембраны в сопряжении окисления с фосфорилированием (П. Митчел), основной энергосопрягающей функции митохондрий, бактерий и других биологических частиц. В фотосинтезирующих мембранах был раскрыт механизм молекулярных генераторов тока (Р. Хубер, Й. Дайзенхоффер, X. Михель). Расшифрована молекулярная структура одиночных ионных каналов (Б. Сакман, Э. Неер). В биофизике сложных систем плодотворными оказались физические идеи термодинамики необратимых процессов (И. Пригожий) и представления о гиперциклах как основе эволюции (М. Эйген). Этот далеко не полный перечень достижений, удостоенных в разные годы Нобелевских премий, позволил определить три основных направления исследований в области современной биофизики — молекулярная биофизика, биофизика клетки и биофизика сложных систем. Основными объектами исследования молекулярной биофизики являются функционально активные вещества и среди них белки и нуклеиновые кислоты. Биофизика клетки имеет дело с надмолекулярными структурами живой клетки, среди которых особое место занимают мембранные структуры клеток и субклеточных частиц. Биофизика сложных систем рассматривает живые организмы различного уровня организации с позиций физико-математического моделирования. Объектами исследования в этом случае являются сообщества клеток, живые ткани, физиологические системы, популяция организмов. Построение моделей является одним из главных этапов биофизического исследования. Живой организм представляет собой чрезвычайно сложную систему, не всегда доступную для точного физического эксперимента. В этом случае плодотворным становится использование физических, аналоговых и математических моделей. Естественная трудность такого метода познания живого мира состоит в определении адекватности модели и в оценке степени ее приближенности к оригиналу. К счастью, в физике разработаны способы преодоления этих трудностей. Можно утверждать, что любое крупное открытие в биофизике получено путем применения моделей. Представление биомакромолекул в виде кристаллов позволило установить молекулярную структуру гемоглобина (Перутц), миоглобина (Кендрью). Важную роль сыграла аналоговая электрическая модель возбудимой мембраны в исследованиях Ходжкина и Хаксли. В биофизике мембран широкое применение получили физические модели мембран в виде моно- и бимолекулярных 6

    7 липидных пленок. С развитием и совершенствованием вычислительной техники моделирование получает новое развитие. Пограничное положение биофизики между биологией и физикой стало, к сожалению, причиной появления лжебиофизики (по терминологии М.В. Волькенштейна). Причина этого заключается в неравномерном развитии физики, химии, с одной стороны, и биологии, медицины и сельскохозяйственных наук — с другой. Объективно существующие «белые пятна» биофизики пытаются заполнить псевдонаучными спекуляциями. Среди них представление об «антиэнтропийности» живых систем, представление об особых полупроводниковых свойствах и даже свойстве проводимости биополимеров («биоплазма»), представление об особых «биополях», неизвестных науке, представления о биологической значимости слабых электромагнитных излучений («некробиотические лучи») и т.д. Раскрытие научной несостоятельности представлений лжебиофизики имеет большое значение, особенно в случае медицины и сельского хозяйства, поскольку многие положения лжебиофизики становятся базой «сверхмодных» методов лечения в медицине и получения «сверхурожаев» в сельском хозяйстве. Частичному исправлению этого положения призвано способствовать данное учебное пособие. В заключение следует подчеркнуть еще одну важную роль современной биофизики. Дело в том, что традиционно описательные биология, медицина и сельскохозяйственные науки все более становятся точными науками. Трудно переоценить в этом случае роль биофизики, призванной исследовать явления жизни с использованием физических представлений и методов.

    8 РАЗДЕЛ I. БИОФИЗИКА МЕМБРАН ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ. СТРУКТУРА, СВОЙСТВА Биофизика мембран — важнейший раздел биофизики клетки, имеющий большое значение для биологии. Многие жизненные процессы протекают на биологических мембранах. Нарушение мембранных процессов — причина многих патологий. Лечение также во многих случаях связано с воздействием на функционирование биологических мембран. 1. Основные функции биологических мембран Элементарная живая система, способная к самостоятельному существованию, развитию и воспроизведению — это живая клетка — основа строения всех животных и растений. Важнейшими условиями существования клетки (и клеточных органелл) являются, с одной стороны, автономность по отношению к окружающей среде (вещество клетки не должно смешиваться с веществом окружения, должна соблюдаться автономность химических реакций в клетке и ее отдельных частях); с другой стороны, связь с окружающей средой (непрерывный, регулируемый обмен веществом и энергией между клеткой и окружающей средой). Живая клетка — открытая система. Единство автономности от окружающей среды и одновременно тесной связи с окружающей средой — необходимое условие функционирования живых организмов на всех уровнях их организации. Поэтому важнейшее условие существования клетки, и, следовательно, жизни — нормальное функционирование биологических мембран. Три основные функции биологических мембран: барьерная обеспечивает селективный, регулируемый, пассивный и активный обмен веществом с окружающей средой (селек- 8

    9 тивный — значит, избирательный: одни вещества переносятся через биологическую мембрану, другие — нет; регулируемый — проницаемость мембраны для определенных веществ меняется в зависимости от генома и функционального состояния клетки); матричная — обеспечивает определенное взаимное расположение и ориентацию мембранных белков, обеспечивает их оптимальное взаимодействие (например, оптимальное взаимодействие мембранных ферментов); механическая — обеспечивает прочность и автономность клетки, внутриклеточных структур. Кроме того, биологические мембраны выполняют и другие функции: энергетическую — синтез АТФ на внутренних мембранах митохондрий и фотосинтез в мембранах хлоропластов; генерацию и проведение биопотенциалов; рецепторную (механическая, акустическая, обонятельная, зрительная, химическая, терморецепция — мембранные процессы) и многие другие функции. Общая площадь всех биологических мембран в организме человека достигает десятков тысяч квадратных метров. Относительно большая совокупная площадь связана с огромной ролью мембран в жизненных процессах. 2. Структура биологических мембран Первая модель строения биологических мембран была предложена в 1902 г. Было замечено, что через мембраны лучше всего проникают вещества, хорошо растворимые в липидах, и на основании этого было сделано предположение, что биологические мембраны состоят из тонкого слоя фосфолипидов. На самом деле, на поверхности раздела полярной и неполярной среды (например, воды и воздуха) молекулы фосфолипидов образуют мономолекулярный (одномолекулярный) слой. Их полярные «головы» погружены в полярную среду, а неполярные «хвосты» ориентированы в сторону неполярной среды. Поэтому и можно было предположить, что биологические мембраны построены из монослоя липидов. В 1925 г. Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов. Гортер и Грендел экстрагировали липиды из гемолизированных эритроцитов ацетоном, затем выпаривали раствор на поверхности воды и измеряли площадь образовавшейся мономолекулярной пленки 9

    10 липидов. На основании результатов этих исследований была высказана идея, что липиды в мембране располагаются в виде бимолекулярного слоя (рис. 1.1). электролит электролит а б Рис Бимолекулярный слой липидов (а); мембрана как конденсатор (б), (С — электрическая емкость, е — диэлектрическая проницаемость) Эту гипотезу подтвердили исследования электрических параметров биологических мембран (Коул и Кертис, 1935 г.): высокое электрическое сопротивление = 10 7 Ом*м 2 и большая емкость = 0,5-Ю» 2 Ф/м 2. Биологическую мембрану можно рассматривать как электрический конденсатор (рис. 1.1), в котором пластинами являются электролиты наружного и внутреннего растворов (внеклеточного и цитоплазмы) с погруженными в них головами липидных молекул. Проводники разделены диэлектрическим слоем, образованным неполярной частью липидных молекул — двойным слоем их хвостов. Липиды — диэлектрики с диэлектрической проницаемостью е = 2. Емкость плоского конденсатора *

    > = :, где электрическая постоянная е о = 8, Ф/м, d — расстояние между пластинами конденсатора, S — площадь пластины. Удельная емкость (на единицу площади) р _ ее о 10

    11 Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, соответствующее в нашем случае толщине липидной части мембраны,, ЕЕо 8,851(Г 12-2 _ d = ^— м«3,5нм. С уд 0,5-НГ 2 Это как раз соответствует по порядку величины толщине неполярной части бимолекулярного слоя липидов, сложенных определенным образом. Однако мембрана — это не только липидный бислой. Имелись экспериментальные данные, которые свидетельствовали о том, что биологическая мембрана состоит и из белковых молекул. Например, при измерении поверхностного натяжения клеточных мембран было обнаружено, что измеренные значения коэффициента поверхностного натяжения значительно ближе к коэффициенту поверхностного натяжения на границе раздела белок-вода (около 10 4 Н/м), нежели на границе раздела липидвода (около 10

    2 Н/м). Эти противоречия экспериментальным результатам были устранены Даниелли и Девсоном, предложившими в 1935 г. так называемую бутербродную модель строения биологических мембран, которая с некоторыми несущественными изменениями продержалась в мембранологии в течение почти 40 лет. Согласно этой модели мембрана — трехслойная. Она образована двумя расположенными по краям слоями белковых молекул с липидным бислоем посередине; образуется нечто вроде бутерброда: липиды, наподобие масла, между двумя «ломтями» белка. Однако по мере накопления экспериментальных данных пришлось в конце концов отказаться и от бутербродной модели строения биологических мембран. Огромную роль в развитии представлений о строении биологических мембран сыграло все большее проникновение в биологию физических методов исследования. Большую информацию о структуре мембран, о взаимном расположении атомов мембранных молекул дает рентгеноструктурный анализ, основанный на дифракции коротковолновых рентгеновских лучей на атомарных структурах. Рентгеноструктурный анализ позволяет обнаруживать упорядоченность в расположении атомов и определять параметры упорядоченных структур (например, расстояния между кристаллографическими плоскостями). Исследования дифракции рентгеновских лучей на мембране подтвердили относительно упорядоченное рас- 11

    12 положение липидных молекул в мембране — двойной молекулярный слой с более или менее параллельно расположенными жирнокислыми хвостами, дали возможность точно определить расстояние между полярной головой липидной молекулы и метильной группой в конце углеводородной цепи. Наибольшие успехи в раскрытии особенностей строения биологических мембран были достигнуты в электронно-микроскопических исследованиях. Как известно, световой микроскоп не позволяет рассмотреть детали объекта, меньшие примерно половины длины световой волны (около 200 нм). В световом микроскопе можно разглядеть отдельные клетки, однако он совершенно непригоден для изучения биологических мембран, толщина которых в 20 раз меньше предела разрешения светового микроскопа. Разрешающая способность микроскопа ограничена явлением дифракции. Поэтому, чем меньше длина волны по сравнению с деталями исследуемого объекта, тем меньше искажения. Предел разрешения пропорционален длине волны. В электронном микроскопе вместо светового пучка на исследуемый объект направляется пучок электронов, разогнанных до больших скоростей. Известно, что электронам с высокими скоростями тоже присущи волновые свойства, в том числе явление дифракции. Однако при достаточно больших скоростях, согласно формуле де Бройля, длина волны мала и соответственно мал предел разрешения. Так, если электроны ускоряются электрическим полем с напряжением 10 5 В, их скорость достигает 10 е м/с, длина волны уменьшается и предел разрешения составляет порядка 0,1 нм, что позволяет рассмотреть отдельные детали строения биологических мембран. В электронном микроскопе достигается увеличение в сотни тысяч раз, что дало возможность исследовать строение клетки, клеточных органелл и биологических мембран. Недостатком электронной микроскопии является деформация живого объекта в процессе исследования. Перед началом электронномикроскопических исследований клетка проходит через многие стадии предварительной обработки: обезвоживание, закрепление, ультратонкий срез, обработка препаратов веществами, хорошо рассеивающими электроны (например, золотом, серебром, осмием, марганцем и т.п.). При этом изучаемый объект значительно изменяется. Несмотря на это, успехи в изучении клетки при помощи электронного микроскопа несомненны. При помощи электронной микроскопии удалось получить изображение биологических мембран, на снимках видно трехслойное строение мембраны. 12

    13 Новая информация о строении мембраны была получена с помощью метода «замораживание-скол-травление». По этому методу клетку охлаждают до очень низкой температуры в жидком азоте. Охлаждение проводится с очень большой скоростью (около 1000 градусов в секунду). При этом вода, содержащаяся в препарате, переходит в твердое аморфное состояние. Затем клетки раскалываются специальным ножом и помещаются в вакуум. Замерзшая вода быстро возгоняется, освобождая поверхность скола (этот процесс и называют травлением). После травления получают реплику (отпечаток со сколотой поверхности) и фотографируют в электронном микроскопе. Замороженные мембраны могут при раскалывании расщепляться в разных направлениях, в том числе и вдоль границы двух липидных монослоев, и поэтому можно видеть их внутреннее строение. Было обнаружено, что имеются белковые молекулы, погруженные в липидный бислой и даже прошивающие его насквозь. Это привело к существенному изменению представлений о строении мембраны. Современное представление о структуре мембраны. Совокупность результатов, полученных физическими и химическими методами исследования, дала возможность предложить новую жидкостно-мозаичную модель строения биологических мембран (Сингер и Никольсон, 1972 г.). Согласно Сингеру и Никольсону, структурную основу биологической мембраны образует двойной слой фосфолипидов, инкрустированный белками (рис. 1.2). Различают поверхностные (или периферические) и интегральные белки. Липиды находятся при физиологических условиях в жидком агрегатном состоянии. Это позволяет сравнить мембрану с фосфолипидным морем, по которому плавают белковые «айсберги». Одним из подтверждений жидкостно-мозаичной модели является и тот факт, что, как установил химический анализ, в разных мембранах соотношение между содержанием белков и фосфолипидов сильно варьирует: в миелиновой мембране белков в 2,5 раза меньше, чем липидов, а в эритроцитах, напротив, белков в 2,5 раза больше, чем липидов. При этом, согласно современной модели, соотношение количества белков и липидов во всех мембранах должно быть примерно одинаково. Тот факт, что не вся поверхность биологической мембраны покрыта белками, показал и метод ядерного магнитного резонанса (см. 3). Так, например, более чем половина поверхности мембраны кишечной палочки образована полярными головами липидов. 13

    14 белки липиды микрофиламенты 15 Изучением сложного химического состава мембран, мембранных белков и других веществ занимается биохимия. Основная область приложения биофизики — структурная основа мембраны, а именно двойной слой фосфолипидных молекул. Молекула фосфолипида лецитина содержит полярную голову (производную фосфорной кислоты) и длинный неполярный хвост (остатки жирных кислот). В голове фосфолипидной молекулы лецитин имеются две заряженные группы, расположенные на некотором расстоянии друг от друга. Два разноименных заряды, равные по абсолютной величине, образуют электрический диполь. В мембранах содержатся разные фосфолипиды. Например, в мембране эритроцитов их около 20 видов. Варьирует химическая формула полярной головы молекулы. У некоторых фосфолипидов головы кроме двух зарядов противоположного знака, создающих дипольный момент, но оставляющих молекулу в целом нейтральной, несут один некомпенсированный отрицательный заряд, вследствие чего молекула оказывается заряженной отрицательно. Углеводородные хвосты фосфолипидной молекулы содержат приблизительно 20 атомов углерода, в хвосте может быть 1-4 двойных ненасыщенных связей. голова б два хвоста Рис Схематичное изображение «двухвостовой» фосфолипидной молекулы (а) и схема образования бислойной мембраны из таких молекул (б) Полярные головы молекул фосфолипидов — гидрофильны, а их неполярные хвосты — гидрофобны. В смеси фосфолипидов с водой термодинамически выгодно, чтобы полярные головы были погружены в состоящую из полярных молекул воду, а их неполярные хвосты были бы расположены подальше от воды. Такое расположение амфифильных (имеющих и гидрофильную, и гидрофобную части) молекул соответствует наименьшему значению энергии Гиббса по сравнению с другими возможными расположениями молекул. 15

    16 Очень существенным является то обстоятельство, что молекулы фосфолипидов имеют два хвоста. Такая молекула в пространстве имеет форму, близкую к цилиндру (рис. 1.3). Из молекул фосфолипидов в водной среде происходит самосборка бислойной мембраны. Присутствие молекул с одним хвостом (лизолецитин), имеющих в пространстве форму, близкую к конусу, разрушает клеточные мембраны (рис. 1.4). Фосфолипидные молекулы, лишенные одного из хвостов, образуют поры в бислойной мембране, нарушается барьерная функция мембран. б пора > у Рис Схематичное изображение «однохвостовой» фосфолипидной молекулы (а) и схема образования поры в мембране из «однохвостовых» молекул 3. Динамика мембран. Подвижность фосфолипидных молекул в мембранах Режим функционирования мембраны сильно зависит от: микровязкости липидного бислоя и подвижности фосфолипидных молекул в мембране, фазового состояния мембранных липидов. Отклонения биофизических характеристик липидного бислоя от нормы связано с разного рода патологиями. Важную роль в физиологии клетки играют фазовые переходы в биологических мембранах. Липидная фаза биологических мембран при физиологических условиях (температуре, давлении, химическом составе окружающей среды) находится в жидком агрегатном состоянии. Это доказано методами флюоресцентного анализа (с использованием флюоресцентных зондов и меток), электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), с использованием спиновых зондов и меток, и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). 16

    17 В нормальном состоянии мембрана не флюоресцирует. Чтобы провести исследования мембраны флюоресцентным методом, надо вводить в мембрану молекулы или молекулярные группы, способные к флюоресценции. В качестве флюоресцентных зондов используются: ДМХ — диметиламинохалкон; МБА — 3-метоксибензантрон; АНС — 1-анилин-нафталин-сульфонат и др. (рис. 1.5). ДМА Рис Структура некоторых флюоресцентных зондов, применяемых при изучении биологических мембран Флюоресцентный анализ дает возможность исследовать подвижность фосфолипидных молекул в мембране, оценить вязкость липидной фазы мембраны (так называемую микровязкость мембран). Микровязкость мембраны можно оценить по изменениям спектров флюоресценции, а также по степени поляризации Р флюоресцентного излучения при освещении мембраны поляризованным светом. Связь степени поляризации Р и микровязкости мембраны Г выражается формулой Перрена и Яблонского: где Р о — степень поляризации света на неподвижных молекулах, R = 8,31 Дж / (К моль) — универсальная газовая постоянная, Т [К] — температура, V — молярный объем флюоресцирующих молекул, т — время жизни возбужденного состояния. Наиболее полные сведения об агрегатном состоянии липидных бислоев дают методы радиоспектроскопии ЭПР и ЯМР. Электронный парамагнитный резонанс — это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны 17

    18 системой парамагнитных частиц (электронов с некомпенсированными спинами), помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны v. Резонансное значение частоты gpb где В — индукция магнитного поля, h — постоянная Планка, g — гидромагнитное отношение, или g-фактор, зависящий от природы парамагнитных частиц. Для свободного электрона g = 2. Магнетон Бора Р = 0,927 10′ 23 Дж / Тл. Практически удобнее оставлять частоту v электромагнитной волны постоянной, а медленно менять индукцию магнитного поля В. Резонансное поглощение энергии будет наблюдаться при В — h V Рис Изменение спектров ЭПР при уменьшении микровязкости Т (увеличении подвижности молекул) — схематичное изображение В ЭПР используются частоты электромагнитного поля v

    Гц и индукция В — 0,3 Тл. Спектром ЭПР называется зависимость мощности поглощения Р электромагнитной волны от величины магнитной индукции В. 18

    19 Чем сильнее взаимодействие между атомами и молекулами образца, тем спектры ЭПР шире. Чем слабее взаимодействие между частицами (больше подвижность молекул), тем уже спектры ЭПР (рис. 1.6). По ширине спектров ЭПР можно судить о подвижности молекул вещества. Так как молекулы фосфолипидов диамагнитны, для ЭПРисследований биомембран используются спин-зонды и спинметки — молекулы или молекулярные группы с неспаренными электронами. Формула одного из таких соединений, часто используемого при ЭПР-спектроскопии мембран, дана на рис Н,С Рис Формула спинового зонда ТЕМПО (2,2,6,6-тетраметилпипередин-1-оксин) Парамагнитные спин-зонды вводятся в липидную мембрану, спектры поглощения спин-зондами электромагнитной волны дают информацию о свойствах липидного окружения, в частности о подвижности липидных молекул в мембране. Несмотря на ценную информацию, которую удалось получить при исследовании биологических объектов методом ЭПР с использованием спиновых зондов, этот метод обладает существенным недостатком — внесение в биологический объект чужеродных молекул-зондов может изменять структуру объекта. От этого недостатка свободен метод ЯМР. Ядерный магнитный резонанс — это явление резкого возрастания поглощения энергии электромагнитной волны системой атомных ядер, обладающих магнитным моментом, помещенных во внешнее магнитное поле, при резонансной частоте волны v 19

    20 =a HSU v у рез 6j, > где g K — ядерный множитель Ланде, имеющий разные значения для разных парамагнитных ядер, для npotohag H = 5,58; Л. Я -ядерный магнетон составляет 1/1836 часть магнетона Бора. Магнитным моментом обладают, например, такие ядра, как JH, g 3 C, 3 jp. Не обладают магнитным моментом такие ядра, как ^ Не, I е О, ^2С. В биологическом объекте содержится много ядер [ Н — протонов, что дает возможность применять для их исследования ЯМР. В ЯМР используются более сильные магнитные поля (В

    1 Тл), а частоты переменного электромагнитного поля меньше ( Гц), чем в ЭПР. Как и в случае ЭПР, спектры ЯМР тем шире, чем больше вязкость и меньше молекулярная подвижность исследуемого объекта. Флюоресцентные, ЭПР- и ЯМР-исследования показали, что подвижность фосфолипидных молекул в мембране сравнительно велика, а вязкость мала. В нормальных физиологических условиях липидная часть мембраны находится в жидком агрегатном состоянии. Вязкость липидной мембраны сравнима с вязкостью подсолнечного масла: Л «(30-100) мпа с (для сравнения: вязкость воды при 20 «С составляет 1 мпа с). Изменение микровязкости липидного окружения мембранных белков-ферментов резко сказывается на их функционировании. Некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что канцерогенез связан со снижением вязкости липидной фазы мембраны, а при старении вязкость, напротив, увеличивается. Разрабатываются диагностические методы, основанные на измерении микровязкости мембран с помощью спин-зондов. Любопытно, что микровязкость мембраны у концов липидных хвостов меньше, чем около полярных голов. Это доказано методом ЭПР с использованием спин-меток. Спиновые метки присоединялись к разным местам фосфолипидной молекулы. Как видно из рис. 1.8, второму положению спиновой метки соответствует более узкий спектр ЭПР, а следовательно, подвижность участка 2 фосфолипидной молекулы больше, чем участ- 20

    21 ка 1. Поэтому в середине мембраны упорядоченность во взаимном расположении хвостов фосфолипидных молекул меньше. Рис Два способа прикрепления спиновой метки к фосфолипидной молекуле и различие спектров ЭПР для этих двух случаев — схематичное изображение Высокая подвижность липидных молекул обусловливает латеральную (боковую) диффузию. Латеральная диффузия — это хаотическое тепловое перемещение молекул липидов и белков в плоскости мембраны. При латеральной диффузии рядом расположенные молекулы липидов скачком меняются местами и вследствие таких последовательных перескоков из одного места в другое молекула перемещается вдоль поверхности мембраны. Среднее квадратичное перемещение S KB молекул при диффузии за время t можно оценить по формуле Эйнштейна: S KB =2VDt. Зная S в, можно найти значение коэффициента латеральной диффузии D. Перемещение молекул по поверхности мембраны клетки за время t определено экспериментально методом флюоресцентных меток — флюоресцирующих молекулярных групп. Флюоресцентные метки делают флюоресцирующими молекулы, движение которых по поверхности клетки можно изучать, например, исследуя под микроскопом скорость расплывания по поверхности клетки флюоресцирующего пятна, созданного такими молекулами. Остроумный прием, используемый с целью определения скорости перемещения флюоресцирующих 21

    22 молекул — фотообесцвечивание. В клетку вводят молекулы, меченые флюоресцентными метками, а затем небольшой участок клеточной поверхности (несколько квадратных микрометров) облучают лазерным лучом. Под действием лазерного излучения молекулы теряют способность флюоресцировать. Измеряя скорость восстановления флюоресценции в обесцвеченной области по скорости уменьшения радиуса обесцвеченного пятна, получают оценку скорости латеральной диффузии. Оказалось, что среднее квадратичное перемещение за секунду фосфолипидной молекулы по поверхности мембраны эритроцита составило около 5 мкм, что сравнимо с размерами клеток. Таким образом, за секунду молекула может обежать всю поверхность небольшой клетки. Обнаруженное среднее квадратичное перемещение белковых молекул составило около 0,2 мкм за секунду. Рассчитанные по формуле Эйнштейна коэффициенты латеральной диффузии для липидов D jran =6 10

    12 м 2 / с, для белков D 6 «Ю- 14 м 2 / с. «»» Частота перескоков (число перескоков в секунду) молекулы с одного места на другое вследствие латеральной диффузии может быть найдена по формуле: где f — площадь, занимаемая одной молекулой на мембране. Для молекул фосфолипидов D jmn = 6 10

    12 м 2 / с, f» 7 10

    19 м 2. Для этих значений частота перескоков v = с» 1. Каждая молекула, таким образом, в среднем претерпевает десятки миллионов перестановок в плоскости мембраны за секунду, то есть характерное время одного перескока т= 10

    8 с. Флип-флоп — это диффузия молекул мембранных фосфолипидов поперек мембраны. Скорость перескоков молекул с одной поверхности мембраны на другую (флип-флоп) определена методом спиновых меток в опытах на модельных липидных мембранах — липосомах (см. 5). Часть фосфолипидных молекул, из которых формировались липосомы, метились присоединенными к ним спиновыми метками. Липосомы подвергались воздействию аскорбиновой кислоты, вследствие чего неспаренные электроны на молекулах пропадали: парамагнитные молекулы становились диамагнитными, что можно было обнаружить по уменьшению площади под кривой спектра ЭПР. 22

    23 Сначала «нейтрализовались» неспаренные электроны молекул, расположенных на внешних поверхностях липосом, что приводило к уменьшению числа неспаренных электронов в два раза. ЭПР затем определялся спин-метками на внутренних, не доступных действию аскорбиновой кислоты поверхностях липосом. Однако площадь под спектрами ЭПР продолжала понижаться, что свидетельствовало об уменьшении числа неспаренных электронов. Это объяснялось перескоками меченных спин-метками молекул с внутренней поверхности бислойной мембраны липосомы на внешнюю — флип-флопом. По скорости уменьшения интенсивности сигнала ЭПР установлено, что половина меченых молекул претерпевает флип-флоп примерно за 6,5 часов, поскольку примерно через это время площадь под кривой спектра ЭПР (а следовательно, число неспаренных электронов) уменьшалась в два раза. Таким образом, перескоки молекул с одной поверхности бислоя на другую (флип-флоп) совершаются значительно медленнее, чем перескоки при латеральной диффузии. Среднее время, через которое фосфолипидная молекула совершает флип-флоп (Т

    1 час), в десятки миллиардов раз больше среднего времени, характерного для перескока молекулы из одного места в соседнее в плоскости мембраны. Сочетание быстрой диффузии молекул вдоль мембраны и очень медленной диффузии поперек мембраны имеет большое значение для функционирования мембран, а именно для матричной функции мембраны (см. 1). Благодаря затрудненному переходу поперек мембраны поддерживается упорядоченность в молекулярной структуре мембраны, ее анизотропия, асимметрия (относительно плоскости мембраны) расположения липидных и белковых молекул, определенная ориентация белков-ферментов поперек мембраны. Это имеет большое значение, например, для направленного переноса веществ через мембрану. 4. Физическое состояние и фазовые переходы липидов в мембранах Вещество при разных температуре, давлении, концентрациях химических компонентов может находиться в различных физических состояниях, например газообразном, жидком, твердом, плазменном. Кристаллическому твердому состоянию вещества могут соответствовать разные фазовые состояния (кристаллические модификации). В качестве примера разных кристаллических модификаций одного и того же вещества — углерода можно назвать графит и алмаз. 23

    24 Из средней школы известно, что характерными, отличительными чертами твердого тела являются собственный объем, форма, механическая прочность; жидкости — собственный объем, отсутствие упругости по отношению к изменению формы и механической прочности, текучесть. Твердое тело может быть как кристаллическим (имеется дальний порядок в расположении частиц на расстояниях, много превышающих межмолекулярные расстояния — кристаллическая решетка), так и аморфным, например стекло (нет дальнего порядка в расположении атомов и молекул). Различие между твердым аморфным телом и жидкостью состоит не в наличии или отсутствии дальнего порядка, а в характере движения частиц. И молекулы жидкости, и молекулы твердого тела совершают колебательные (иногда вращательные) движения около положения равновесия. Через некоторое среднее время — «время оседлой жизни» — происходит перескок молекулы в другое положение равновесия. Различие заключается в том, что время оседлой жизни в жидкости много меньше, чем в твердом теле. Липидные бислойные мембраны при физиологических условиях — жидкие, время оседлой жизни фосфолипидных молекул в мембране мало: т = 10

    8 с. Вместе с тем, молекулы в мембране размещены не беспорядочно, в их расположении наблюдается дальний порядок. Фосфолипидные молекулы находятся в двойном слое, а их гидрофобные хвосты приблизительно параллельны друг другу. Есть порядок и в ориентации полярных гидрофильных голов. Физическое состояние, при котором есть дальний порядок во взаимной ориентации и расположении молекул, но агрегатное состояние жидкое, называется жидкокристаллическим состоянием. аморфная нематическая смектическая холестическая фаза фаза фаза фаза» ё* ф ф ******Ф б ******* ******* 24 Рис Расположение молекул в аморфном (а) и жидкокристаллическом состояниях (б, в, г)

    25 Жидкие кристаллы могут образовываться не во всех веществах, а в веществах из «длинных молекул» (поперечные размеры которых меньше продольных). Могут быть различные жидкокристаллические структуры (рис. 1.9, б, в, г): нематическая (нитевидная), когда длинные молекулы ориентированы параллельно друг другу; смектическая (мылообразная) — молекулы параллельны друг другу и располагаются слоями; холестерическая — молекулы располагаются параллельно друг другу в одной плоскости, но в разных плоскостях ориентации молекул разные (повернуты на некоторый угол в одной плоскости относительно другой). Бислойная липидная фаза биологических мембран соответствует смектическому жидкокристаллическому состоянию. Жидкокристаллические структуры очень чувствительны к изменению температуры, давления, химического состава, электрическому полю. Это определяет динамичность липидных бислойных мембран — изменение их структуры при различных, даже небольших изменениях внешних условий или химического состава. При изменении условий вещество может перейти в другое фазовое состояние (например, из газообразного в жидкое, из жидкого в твердое, из одной кристаллической модификации в другую). Как показано физическими методами исследования: дилатометрией (измерение коэффициента объемного расширения) и калориметрией (измерение теплоемкости), методом рентгеноструктурного анализа и др., липидная часть биологических мембран при определенных температурах испытывает фазовый переход первого рода. Согласно данным рентгеноструктурного анализа, радиоспектроскопии, флюоресцентного анализа, инфракрасной спектроскопии и других физических исследований, в фосфолипидной мембране при понижении температуры происходит переход из жидкокристаллического в гель-состояние, которое условно иногда называют твердокристаллическим (рис. 1.10). В гель-состоянии молекулы расположены еще более упорядочено, чем в жидкокристаллическом. Все гидрофобные углеводородные хвосты фосфолипидных молекул в гель-фазе полностью вытянуты строго параллельно друг другу (имеют полностью транс-конформацию). В жидком кристалле за счет теплового движения возможны транс-гош-переходы, хвосты молекул изгибаются, их параллельность друг другу в отдельных местах нарушается, особенно сильно в середине мембраны. 25

    26 0,48 им 2 л _, 0,58 нм 2 АААА1 жидкий кристалл повышение температуры Рис Изменение структуры мембраны при переходе из жидкокристаллического в гель-состояние и обратно при изменении температуры Толщина мембраны в гель-фазе поэтому больше, чем в жидком кристалле (рис. 1.10). Однако при переходе из твердого в жидкокристаллическое состояние объем несколько увеличивается, потому что значительно увеличивается площадь мембраны, приходящаяся на одну молекулу (от 0,48 нм 2 до 0,58 нм 2 ). Так как в твердокристаллическом состоянии больше порядок, чем в жидком кристалле, ему соответствует меньшая энтропия. Для нормального функционирования мембрана должна быть в жидкокристаллическом состоянии. Поэтому в живых системах при продолжительном понижении температуры окружающей среды наблюдается адаптационное изменение химического состава мембран, обеспечивающее понижение температуры фазового перехода. Температура фазового перехода понижается при увеличении числа ненасыщенных связей в жирно-кислотных хвостах. В хвосте молекулы может быть до четырех ненасыщенных связей. В зависимости от химического состава липидных мембран температура фазового перехода гель — жидкий кристалл может меняться от -20 С (для мембран из ненасыщенных липидов) до +60 С (для насыщенных липидов). Увеличение числа ненасыщенных липидов в мембране при понижении температуры обитания наблюдается у микроорганизмов, растительных и животных клеток. Любопытный пример приспособления клеточных мембран к температурным условиям — изменение температуры фазового перехода (за счет изменения химического состава мембранных липидов) ноги полярного оленя. Темпера- 26

    27 тура вдоль ноги полярного оленя от копыта до туловища может зимой меняться от -20 «С до +30 С. Клеточные мембраны у дистальной части ноги оленя содержат больше ненасыщенных фосфолипидов. По-видимому, первичный механизм криоповреждений (повреждений при охлаждениях) биологических мембран связан с фазовым переходом в гель-состояние. Поэтому биологические мембраны содержат большое количество холестерина, уменьшающего изменения в мембране, сопровождающие фазовый переход. У некоторых микроорганизмов биологические мембраны находятся при температурах, лишь на немного превышающих температуру фазовых переходов липидов. Мембрана содержит десятки разных липидов, которым соответствуют разные температуры фазового перехода, в том числе близкие к физиологическим. При понижении температуры в мембране происходят фазовые превращения в липидном бислое. В работах В.Ф. Антонова доказано, что при фазовых переходах из гель- в жидкокристаллическое состояние и обратно в липидном бислое образуются сквозные каналы, радиусом 1-3 нм, по которым через мембрану могут переноситься ионы и низкомолекулярные вещества. Вследствие этого при температуре фазового перехода резко увеличивается ионная проводимость мембраны. Увеличение ионной проводимости мембран может спасти клетку от криоповреждений за счет увеличения выхода из клетки воды и солей — привести к нарушению ее барьерной функции, что препятствует кристаллизации воды внутри клетки. Повышение ионной проводимости мембран при фазовом переходе, возможно, позволяет поддерживать метаболический обмен некоторых микроорганизмов. Большой интерес представляет этот эффект для объяснения термо- и хеморецепции. Известно, что перенос ионов через мембрану лежит в основе формирования биопотенциалов, изменение ионной проводимости обусловливает нервный импульс. Не исключено, что нервный импульс, свидетельствующий о понижении или повышении температуры, образуется за счет изменения ионной проницаемости липидного бислоя при фазовом переходе мембранных липидов. По-видимому, и некоторые виды хеморецепции могут быть связаны с фазовым переходом мембранных липидов, поскольку фазовый переход может быть вызван не только изменением температуры, но и изменением химического состава окружаю- 27

    28 щей среды. Например, доказано, что при данной температуре фазовый переход из жидкокристаллического состояния в гельсостояние может быть вызван увеличением концентрации Са 2+ в физиологическом диапазоне от 1 до 10 ммоль/л в водном растворе, окружающем мембрану. 5. Модельные липидные мембраны Липосомы, или фосфолипидные везикулы (пузырьки), получают обычно при набухании сухих фосфолипидов в воде или при впрыскивании раствора липидов в воду. При этом происходит самосборка бимолекулярной липидной мембраны. Минимуму энергии Гиббса отвечает замкнутая сферическая одноламеллярная форма мембраны. При этом все неполярные гидрофобные хвосты находятся внутри мембраны и ни один из них не соприкасается с полярными молекулами воды (рис. 1.11). Однако чаще получаются несферические многоламеллярные липосомы, состоящие из нескольких бимолекулярных слоев, — многослойные липосомы. вода Рис Схема строения однослойной липосомы Отдельные бимолекулярные слои многослойной липосомы отделены водной средой. Толщина липидных слоев составляет, в зависимости от природы липидов, 6,5-7,5 нм, а расстояние между ними — 1,5-2 нм. Диаметр многослойных липосом колеблется в пределах от 60 нм до 400 нм и более. Однослойные липосомы можно получить различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более. 28

    29 Липосомы представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они служат моделью для исследований различных свойств клеточных мембран. Липосомы нашли непосредственное применение в медицине. Например, можно заключить внутрь липосом лекарственный препарат и использовать как фосфолипидную микрокапсулу для доставки лекарства в определенные органы и ткани. Липосомы не токсичны (при правильном подборе липидов), полностью усваиваются организмом, способны преодолевать некоторые биологические барьеры. Так, инсулин, заключенный в липосому, защищен от действия пищеварительных ферментов. В настоящее время выясняется возможность вводить этот препарат в липосомах перорально, что может избавить больных диабетом от необходимости систематических уколов. Проводятся работы по разработке методов липосомальной терапии опухолей, ферментативной недостаточности, атеросклероза. Изучается возможность прицельной доставки лекарственного препарата, заключенного в липосомах, к больному органу или даже к больному участку (в частности, к пораженному участку сердца). Для этого к липосоме присоединяется белковая молекула — антитело к соответствующему мембранному антигену органа-мишени. Липосомы с током крови разносятся по всему организму и задерживаются, оказавшись около органа-мишени. Несмотря на заманчивые перспективы липосомальной терапии, еще имеется достаточно много нерешенных вопросов. торус Рис Образование плоской бислойной липидной мембраны 29

    30 Плоские бислойиые липидные мембраны (БЛМ) — другой тип модельных мембран. Такие мембраны получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пластика (например, фторопласта), погруженной в водную среду. На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остается пленка липида. Эта пленка спонтанно утончается до тех пор, пока не образуется бимолекулярный слой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка-торуса у краев отверстия (рис. 1.12). Плоские липидные мембраны, наряду с липосомами, широко используются в качестве моделей для изучения электрических свойств мембраны, их проницаемости и других научных исследований. С помощью модельных мембран изучают ряд функций биологических мембран, а том числе, барьерную (например, селективность проницаемости — хорошую проницаемость для воды и плохую для ионов). Можно моделировать биологический транспорт, вводя в модельную мембрану молекулы-переносчики. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ, ЗАДАЧИ, ЗАДАНИЯ 1. Удельная электрическая емкость мембраны аксона, измеренная внутриклеточным микроэлектродом, оказалась равной 0,5 микрофарад/см 2. По формуле плоского конденсатора оценить толщину гидрофобного слоя мембраны с диэлектрической проницаемостью Какое расстояние на поверхности мембраны эритроцита проходит молекула фосфолипида за 1 секунду в результате латеральной диффузии? Коэффициент латеральной диффузии принять равным 10

    12 м 2 /с. Сравните с окружностью эритроцита диаметром 8 мкм. 3. При фазовом переходе мембранных фосфолипидов из жидкокристаллического состояния в гель толщина бислоя изменяется. Как при этом изменится электрическая емкость мембраны? Как изменится напряженность электрического поля в мембране? 4. С помощью спин-меченых молекул фосфолипидов установлен градиент вязкости по толщине мембраны. Опишите эксперимент. Где вязкость выше: у поверхности мембраны или в ее центре? 30

    МЕДИЦИНСКАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ФИЗИКА. ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ 2-е изд., испр. и доп. Учебное пособие для вузов 1

    В учебном пособии представлены лабораторные работы по физике, которые содержат изложение теории изучаемых явлений, описание лабораторных установок и порядок выполнения работы, а также последовательность обработки результатов измерений. В конце описания каждой работы приводится список вопросов и тестов для контроля усвоения материала, большое количество которых обеспечивает индивидуальный подход для каждого студента при защите лабораторных работ. Особое внимание уделено подбору лабораторных работ, имеющих прикладное значение в современной биологии и медицине. В пособии приведено большое количество рисунков, графиков и гистограмм, способствующих наглядному представлению физической сущности рассматриваемого явления и лучшему восприятия прочитанного материала.

    Шаг 1. Выбирайте книги в каталоге и нажимаете кнопку «Купить»;

    Шаг 2. Переходите в раздел «Корзина»;

    Шаг 3. Укажите необходимое количество, заполните данные в блоках Получатель и Доставка;

    Шаг 4. Нажимаете кнопку «Перейти к оплате».

    На данный момент приобрести печатные книги, электронные доступы или книги в подарок библиотеке на сайте ЭБС возможно только по стопроцентной предварительной оплате. После оплаты Вам будет предоставлен доступ к полному тексту учебника в рамках Электронной библиотеки или мы начинаем готовить для Вас заказ в типографии.

    Внимание! Просим не менять способ оплаты по заказам. Если Вы уже выбрали какой-либо способ оплаты и не удалось совершить платеж, необходимо переоформить заказ заново и оплатить его другим удобным способом.

    Оплатить заказ можно одним из предложенных способов:

  • Безналичный способ:
    • Банковская карта: необходимо заполнить все поля формы. Некоторые банки просят подтвердить оплату – для этого на Ваш номер телефона придет смс-код.
    • Онлайн-банкинг: банки, сотрудничающие с платежным сервисом, предложат свою форму для заполнения. Просим корректно ввести данные во все поля.
      Например, для Сбербанк Онлайн требуются номер мобильного телефона и электронная почта. Для Альфа-банка потребуются логин в сервисе Альфа-Клик и электронная почта.
    • Электронный кошелек: если у Вас есть Яндекс-кошелек или Qiwi Wallet, Вы можете оплатить заказ через них. Для этого выберите соответствующий способ оплаты и заполните предложенные поля, затем система перенаправит Вас на страницу для подтверждения выставленного счета.

    Наличными оплата принимается через терминалы. Без процентов можно оплатить через отделения салонов связи Евросеть или Связной или через Сбербанк. В терминалах других систем возможно взимание комиссий.

    Если оплата производится через салон связи: код платежа необходимо назвать оператору и указать, что платеж для Яндекс.Денег.

    Если Вы находитесь за пределами РФ, список компаний, принимающих подобные платежи в Вашей стране, будет виден в окне с кодом платежа.

    Возможен ли возврат моего заказа? Возврат средств?

    Согласно Постановлению 55 Правительства РФ, книги входят в список непродовольственных товаров, которые не подлежат обмену и возврату. Поэтому, если Вы оплатили и получили заказ, надлежащего качества и в составе, аналогичном оплаченному, возврат не производится.

    В остальных случаях возврат заказа и денежных средств обговаривается отдельно. Вы можете связаться с нами по телефону +7 (495) 744-00-12 или электронной почте [email protected] .

    Доставка заказов печатных книг осуществляется через партнерскую сеть службу доставки. Доставка данной службой осуществляется в пределах Российской Федерации. В некоторые страны СНГ доставка возможна через транспортные компании по согласованию с сотрудниками Издательства.

    Обратите внимание, что для корректной и своевременно доставки необходимо верно указать свой мобильный телефон , чтобы сотрудник курьерской службы мог с Вами связаться. Указывать телефон необходимо, начиная с цифры 9 (без восьмерки)!

    При оформлении заказа можно выбрать один из способов доставки:

      С амовывоз с пункта выдачи заказов. На территории России открыто большое количество пунктов выдачи. Для выбора данного способа доставки при оформлении заказа в блоке «Доставка» нажмите на « Самовывоз », выберите населенный пункт. (Начните печатать название, появится выпадающий список городов. Выбрать нужно из тех, что есть в списке.) После выбора на карте отразятся все возможные пункты выдачи в данном населенном пункте. Карту можно приблизить. Справа от подходящего пункта выдачи в открывшемся окне необходимо нажать кнопку «Выбрать пункт», тогда адрес появится в строке «Адрес самовывоза». В отдельном окне видны часы работы пункта выдачи, ориентировочная дата готовности заказа, стоимость доставки и поясняющая информация (если таковая имеется). В этом же блоке Вы увидите стоимость доставки и срок хранения заказа.

    К урьерская (адресная) доставка. Для выбора данного способа доставки при оформлении заказа нажмите на слово « Курьерская ». Необходимо указать Ваш населенный пункт (начните водить название в строке «Город», выбрать необходимо из появившегося списка). Затем заполните адрес доставки, начиная с улицы. В комментариях можно указать дополнительные сведения. Сотрудник курьерской службы всегда предварительно звонит перед приездом для согласования времени и адреса, однако можно дополнительно подчеркнуть необходимость звонка заранее. Просим обратить внимание, что без подтверждения от Вас готовности принять заказ, курьер не выезжает по адресу! Время ожидания курьера на адресе составляет строго 15 мин.

    Выбрать удобную дату доставки можно из списка дней, что выделены зеленым. В этой же форме Вы увидите стоимость курьерской доставки.

    Читайте так же:  Новшества в оплате работы в выходные, праздники и ночное время. Приказ доплата в праздничные дни

admin